手性分析方法開發(fā)過程中，根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)或者是進(jìn)行初步的開發(fā)嘗試，確定了影響分離有效性的關(guān)鍵因素如色譜柱的類型以及流動相的種類以及操作模式之后，就需要對是否需要使用添加劑以及哪一種添加劑做出選擇，一些其他的操作條件諸如流速，色譜柱柱溫等進(jìn)行優(yōu)化，以此獲得良好的分離效果。

　　1、色譜柱溫度的影響

　　如我們所知，溫度在HPLC方法開發(fā)中占據(jù)舉足輕重的地位，在范式方程中表達(dá)為傳質(zhì)阻力項(xiàng)，溫度越高，對于流動相而言其粘度越小(如下表乙醇的粘度隨溫度的變化)，而儀器背壓也就越低。更重要的是，升高溫度減小了傳質(zhì)阻力，溶質(zhì)在兩相之間的分配速率亦會隨之增加，色譜柱的理論塔板高度降低，色譜柱的柱效亦會增加。

　　因此增加色譜柱的溫度，可以提高色譜柱的柱效，體現(xiàn)在色譜峰上，峰形更加尖銳，峰寬降低，并一般多伴隨色譜峰的容量因子減??；降低色譜柱的溫度，則色譜峰峰形變鈍，峰寬增加，并一般多伴隨容量因子增加。

　　而對于選擇性因子以及拖尾因子而言，需要具體情況具體分析，分別對待。此外，不同的手性液相色譜柱所允許的操作溫度范圍不同，在方法開發(fā)的時(shí)候，注意不要超過色譜柱所耐受的溫度范圍，以免損傷色譜柱，導(dǎo)致使用壽命減短。

　　2、有機(jī)溶劑中痕量水的影響

　　在正相HPLC操作模式中，我們常使用正己烷、正庚烷作為非極性洗脫劑，乙醇、異丙醇等醇類作為極性洗脫劑，而有機(jī)醇類流動相在開瓶之后，會吸收空氣中的水分，使得有機(jī)溶劑中混入一些痕量的水，而這些痕量的水，有時(shí)候會對手性分析方法的開發(fā)帶來干擾(有時(shí)負(fù)面影響，有時(shí)正面影響)，甚至影響分析方法開發(fā)的進(jìn)程以及分析方法的轉(zhuǎn)移，特別是對于涂覆型的多糖衍生物的手性色譜柱。

　　選擇了合適的色譜柱，流動相的組成以及操作模式只是手性分析方法開發(fā)成功的必要條件，還需要對色譜儀器的操作條件進(jìn)行優(yōu)化，如流動相中的添加劑的種類以及添加量，流動相的流速的大小，溶解樣品所用的溶劑等，均對分析方法主要關(guān)注點(diǎn)如分離度，拖尾因子，保留時(shí)間產(chǎn)生很大的影響。