色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此承擔(dān)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的核心，也稱為“色譜芯”。那么，影響“色譜芯”的分離效果有哪些因素呢？下面我們將簡要概述色譜柱所涉及的公式和理論，希望能幫助您遇到問題時(shí)進(jìn)行排查。

柱效用于比較不同色譜柱的性能。柱效是描述色譜柱性能引用頻率最高的參數(shù)之一，以理論塔板數(shù) N 表示。

理論塔板數(shù)高的色譜柱柱效更高，色譜圖中的峰寬更窄，分離效果更好。

柱效能反映分離峰的寬窄。柱效高，分離峰窄，才可能有好的分離度。柱效高是高分離度的前提。柱效受柱參數(shù)（內(nèi)徑、柱長、粒度）、洗脫液類型（特別是粘度）、流速或平均線速度的影響。柱效還受化合物及其保留的影響。

常使用每米理論塔板數(shù)（N/m）進(jìn)行色譜柱的比較，但需要在相同的色譜溫度條件和保留因子（k）下進(jìn)行。對于較小的固定相，柱效對分離更為重要。

過去稱為容量因子或 k′（k 值），保留因子是指樣品組分停留在固定相中相對其駐留在流動相中的時(shí)間之比。用保留時(shí)間除以峰不保留時(shí)間（t₀）進(jìn)行計(jì)算。

選擇性因子是對兩個(gè)色譜峰之間時(shí)間或距離的最大測量值。如果 α = 1，則兩個(gè)色譜峰具有相同的保留時(shí)間并共洗脫。

選擇性因子的定義是容量因子之比。在圖 1 中，您會看到，峰 A 和峰 B 之間的選擇性比峰 B 和峰 C 的選擇性更好。圖中提供了計(jì)算說明。

改變流動相或固定相都可以改變選擇性。溫度也是調(diào)節(jié)選擇性的一個(gè)因素。

分離度代表色譜柱分離目標(biāo)峰的能力，因此，分離度越高，兩峰之間越容易得到基線分離。從方程 5 中可以看出，分離度與柱效、選擇性和保留值相關(guān)。可以通過改善這些因素來提高分離度。

在圖 2 中，我們可以看到每個(gè)參數(shù)在分離過程中的不同作用。所有這些參數(shù)都呈效應(yīng)遞減趨勢。即取值越大，對分離度的影響就越小。

如果將柱長加倍，將得到更多的理論塔板數(shù)，但分離時(shí)間也將延長 2 倍，而分離度只能得到 2 的平方根即 1.4倍的提高。

如果要對色譜峰進(jìn)行定量，那么分離度最小應(yīng)等于 1。分離度要達(dá)到 0.6，才能分辨兩個(gè)等高峰間的峰谷。

如需建立耐用方法，理想分離度值一般應(yīng)大于等于 1.7。基線分離并確保最準(zhǔn)確定量結(jié)果的分離度應(yīng)為 1.6。

壓力方程（方程 6）包含影響系統(tǒng)壓力的 5 個(gè)重要參數(shù)：溶劑粘度 (h)、流速 (F)、柱長 (L)、色譜柱半徑 (r) 和填料粒徑 (dp)。熟悉壓力方程將能很好地理解這些重要參數(shù)對系統(tǒng)壓力的影響。

van Deemter 方程是將柱效作為線速度（u）或流速的函數(shù)對柱效（用 H 表示，見方程 7）進(jìn)行評價(jià)。

H – 稱為塔板高度，或理論塔板高度，用柱長（L）除以理論塔板數(shù)進(jìn)行計(jì)算。我們的目標(biāo)是得到小塔板高度。

可以通過使用較小填料色譜柱、優(yōu)化線速度，以及使用低粘度流動相，更有效地實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。隨著粒徑減小，優(yōu)化線速度將增大。

當(dāng)樣品中存在各種類型的組分時(shí)，我們很難用等梯度洗脫（即，恒定流動相組成）在適當(dāng)時(shí)間內(nèi)讓所有組分都得到分離。

梯度洗脫是一個(gè)隨時(shí)間提高流動相強(qiáng)度的過程，最終使分析速度更快、峰形和定量結(jié)果更好。通過梯度洗脫，峰寬通常將更窄，并保持恒定。

在梯度方程中，S 為常數(shù)，與所分離的分子大小有關(guān)。小分子的 S 值約為 4 到 6，多肽和蛋白質(zhì)的 S 介于 10到 1000 之間。

現(xiàn)在，經(jīng)常使用不同尺寸的色譜柱，或使其更短（例如，為實(shí)現(xiàn)更高通量），或使用窄內(nèi)徑柱（如，用于質(zhì)譜檢測）。必須按比例縮短梯度時(shí)間（tG）或減小流速（F），以補(bǔ)償柱體積的減少。

使用相同色譜柱時(shí)，如果想保持相同的梯度斜率和 k* 值，則需在梯度時(shí)間（tG）內(nèi)按比例調(diào)整梯度組成（DF）改變速率或流速（F）。

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