在藥物研發(fā)分析中，液相色譜儀的一些常見錯(cuò)誤操作可能會(huì)導(dǎo)致這臺(tái)昂貴的設(shè)備在使用幾次后就出現(xiàn)故障。那么，在液相色譜分析實(shí)驗(yàn)室中有哪些操作是應(yīng)該避免的呢？

1、流動(dòng)相不進(jìn)行過(guò)濾。

由于塵埃或其他雜質(zhì)顆粒會(huì)磨損柱塞、密封圈、缸體和單向閥，因此應(yīng)該在使用前清除流動(dòng)相中的固體顆粒。流動(dòng)相最好在玻璃容器中進(jìn)行蒸餾，常用的方法是通過(guò)過(guò)濾，可以使用濾膜（0.2μm或0.45μm）等過(guò)濾器。泵的進(jìn)料口應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的過(guò)濾器需要定期清潔或更換。

2、使用后未能及時(shí)清潔泵。

流動(dòng)相中不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，而含有緩沖液的流動(dòng)相在泵內(nèi)不應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間存留，特別是在停泵過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間的情況下。如果剩余的含緩沖液的流動(dòng)相長(zhǎng)時(shí)間留在泵內(nèi)，可能會(huì)因蒸發(fā)或泄漏，甚至因溶液靜置而析出鹽微細(xì)晶體。這些晶體同樣會(huì)損壞密封環(huán)和柱塞等部件。

因此，在徹底清洗泵之后，必須注入純水，然后更換為適合色譜柱保存并有利于泵維護(hù)的溶劑（對(duì)于反相鍵合硅膠固定相，可以使用甲醇或甲醇-水溶液）。

3、流動(dòng)相走空

在泵工作時(shí)，必須注意防止溶劑瓶中的流動(dòng)相耗盡，否則即使是空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)對(duì)柱塞、缸體或密封環(huán)造成磨損，最終導(dǎo)致泄漏。

如果沒(méi)有流動(dòng)相排出，并且沒(méi)有壓力指示，應(yīng)該怎么處理呢？

泵內(nèi)可能積累了大量氣體，這時(shí)可以打開泄壓閥，讓泵以較大流量（例如5ml/min）運(yùn)行，以排出氣泡。同時(shí)也可以在泵出口處使用一個(gè)50ml的針筒來(lái)輔助排出氣體。另一個(gè)可能的原因是密封環(huán)磨損，這時(shí)需要進(jìn)行更換。

4、壓力和流量不穩(wěn)定了？

可能出現(xiàn)問(wèn)題的原因包括氣泡的存在，需要進(jìn)行排查；或者是單向閥內(nèi)有異物，這時(shí)可以卸下單向閥，并用丙酮進(jìn)行超聲清洗。有時(shí)，砂濾棒內(nèi)也可能存有氣泡，或者被細(xì)小的鹽晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯?duì)此，可以卸下砂濾棒，浸入流動(dòng)相中進(jìn)行超聲去氣泡，或者迅速將砂濾棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）以去除微生物，隨后再將鹽溶解并立即進(jìn)行清洗。

5、壓力為什么會(huì)過(guò)高或過(guò)低？

管道可能出現(xiàn)了堵塞，需要進(jìn)行清理和清洗。而壓力降低的原因可能是管道存在泄漏。在檢查堵塞或泄漏時(shí)，應(yīng)逐段進(jìn)行仔細(xì)檢查。在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，由于多種溶劑混合且組成不斷變化，可能會(huì)出現(xiàn)一些特殊問(wèn)題，這些問(wèn)題需要高度重視。

在液相色譜分析中，對(duì)于組分復(fù)雜的樣品，通常采用梯度洗脫的方法。這種方法是在同一個(gè)分析周期內(nèi)，根據(jù)一定的程序不斷調(diào)整流動(dòng)相的濃度比例，稱為梯度洗脫。通過(guò)這種方式，可以使得復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異較大的組分，根據(jù)各自的容量因子k，達(dá)到良好的分離效果。梯度洗脫的優(yōu)點(diǎn)包括：1. 縮短分析時(shí)間；2. 提高分離效率；3. 改善峰型，減少拖尾現(xiàn)象；4. 增強(qiáng)靈敏度。然而，有時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致基線漂移的問(wèn)題。

6、梯度洗脫時(shí)流動(dòng)相選擇不當(dāng)

需要注意溶劑之間的互溶性，不能將不相互混溶的溶劑用作梯度洗脫的流動(dòng)相。有些溶劑在特定比例下是可以混溶的，但一旦超過(guò)這個(gè)范圍，它們就會(huì)變得不再互溶，因此在使用時(shí)要格外留意。

當(dāng)有機(jī)溶劑與緩沖液混合時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)鹽晶體的析出，特別是在使用磷酸鹽時(shí)需要特別注意。

7、被忽視的空白梯度洗脫

梯度洗脫所用溶劑的純度要求較高，以確保良好的重復(fù)性。在分析樣品之前，必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以識(shí)別溶劑中的雜質(zhì)峰，因?yàn)樵谌跞軇┲?，雜質(zhì)會(huì)積聚在色譜柱的頂部，并在用強(qiáng)溶劑時(shí)被洗脫下來(lái)。此外，用于梯度洗脫的溶劑需要進(jìn)行脫氣，以避免混合過(guò)程中產(chǎn)生氣泡。

8、忽視了溶劑混合導(dǎo)致的粘度變化。

混合溶劑的粘度通常會(huì)隨著組成的不同而發(fā)生變化，因此在梯度洗脫時(shí)，壓力往往會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)。例如，甲醇和水的粘度都相對(duì)較低，但當(dāng)它們以相似的比例混合時(shí)，粘度會(huì)顯著增加，此時(shí)的柱壓大約是使用純甲醇或水作為流動(dòng)相時(shí)的兩倍。因此，在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，需要特別注意避免壓力超過(guò)輸液泵或色譜柱所能承受的最大值。

為了減輕這種壓力波動(dòng)帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)驗(yàn)者可以采取一些預(yù)防措施。首先，可以嘗試調(diào)整梯度程序，使得粘度變化較大的溶劑配比變化更為平緩，避免急劇的濃度躍遷，這樣可以有效減少柱壓的瞬間激增。其次，選擇粘度相對(duì)穩(wěn)定的溶劑組合進(jìn)行梯度洗脫，或者通過(guò)加入適量的添加劑來(lái)調(diào)節(jié)混合溶劑的粘度，使其在整個(gè)梯度范圍內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定。

此外，梯度洗脫過(guò)程中還需注意溫度對(duì)溶劑粘度和分離效果的影響。保持色譜柱和流動(dòng)相恒溫，有助于減少由于溫度變化引起的溶劑粘度波動(dòng)，從而提高分析的穩(wěn)定性和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)者可以利用色譜儀的溫度控制系統(tǒng)，設(shè)定合適的柱溫和流動(dòng)相溫度，確保分析條件的一致性。

最后，定期維護(hù)和檢查液相色譜系統(tǒng)同樣至關(guān)重要。檢查管道、單向閥、砂濾棒等部件是否堵塞或磨損，及時(shí)更換老化的密封環(huán)和柱塞，保持輸液泵和色譜柱的良好狀態(tài)，可以有效減少因設(shè)備故障導(dǎo)致的分析誤差。同時(shí)，記錄和分析每次梯度洗脫的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，不斷優(yōu)化梯度程序和操作細(xì)節(jié)，也是提升液相色譜分析效率和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟。通過(guò)這些綜合措施，可以最大限度地發(fā)揮液相色譜儀在藥物研發(fā)分析中的價(jià)值。